Các cột HPLC hấp phụ thấp với hệ thống MaxPeak High Performance Surface (MaxPeak HPS)

CÁC THỬ THÁCH TRONG PHÂN TÍCH SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CỦA CÁC CHẤT PHÂN TÍCH NHẠY VỚI KIM LOẠI

Do khả năng sản xuất và khả năng chịu được áp lực cao mà thép không gỉ từ lâu đã là vật liệu được ưa chuộng để làm cột HPLC. Tuy nhiên, Phần cưng thép không gỉ dễ bị ăn mòn và co thể tác động tiêu cực đến hình dạng peak và khả năng thu hồi một số chất phân tích. Vì vậy, Titanium và Hợp Kim Niken-Coban được sử dụng làm vật liệu thay thế cho các từng ứng dụng cụ thể. Trong khi các giải pháp thay thế này thể hiện khả năng chống ăn mòn, nhưng chúng vẫn là những thách thức lớn đối với một số chất phân tích.

Sự tương tác giữa một số chất phân tích và bề mặt kim loại là do sự phân chia electron . Hầu hết các kim loại đều được bao phủ bởi một lớp oxide kim loại mỏng. Sự chuyển ion kim loại trong lớp này bị thiếu electron, dẫn đến chúng hoạt động như acid Lewis. Trong khi đó, nhiều phân tử chất phân tich chứac các nguyên tố giàu điện tử, chẳng hạn như nhóm Photphat và cacboxylat. Những Phân tử BAZE Lewis co thể hấp phụ để chuyển ion kim loại trên bề mặt cột HPLC. Những tương tác này trở thành ảnh hưởng lớn nếu một phân tử chứa nhiều phân tử giàu electron được sắp xếp như vậy nó có thể hấp phụ tạo nhiều vết xước. Trong thưc tế, điều này làm hình dạng peak săc ký xấu, mất chất phân tích và làm kêt quả định lượng không chính xác.

Giải pháp khác, các máy sắc ký thường  thêm chất phụ gia chelat như EDTA vào pha động hoặc chất pha loãng mẫu để giải quyết các vấn đề với cột kim loại. Các chất Chelat dễ bay hơi được thêm vào pha động trong LC-MS như acid citric và acetylacetone. Tuy nhiên, việc sử dụng hững tác nhân chelat có thể tác động tiêu cực tới độ chọn lọc sắc ký và hiệu suất MS.

Do những hiệu ứng này, các phân tích HPLC của các hợp chất nhạy cảm với kim loại đã đòi hỏi sử dụng cột không có kim loại. Polyether ether xeton (PEEK) đã từng là vật liệu được lựa chọn để sử dụng thay cho thép không gỉ. Trong khi PEEK  phù hợp với HPLC (<5000 psi), nhưng nó không đủ độ bền cơ học cho hoạt động trong điều kiện áp suất cực cao (≥5000 psi). Vì vậy, các Ống PEEK bọc thép đã được phát triển cho phép vận hành áp suất cao hơn, cho thấy đường kính bên trong của ống PEEK có thể có nhiều sự biến đổi hơn so với đường kính của ống thép không gỉ hoặc ống Titan. Do đó, sự thay đổi tỷ lệ lưu giữ chân tương đối lớn co thể gặp phải khi chuyển đổi giữa các cột dòng PEEK. Ngoài ra, PEEK không tương thích với một số dung môi, đặc biệt là tetrahydrofuran (THF), dimethyl sulfoxide (DMSO), và các dung môi clo hóa như cloroform và metylen clorua. Hơn nữa, PEEK là một polyme tương đối kỵ nước. Do tương tác thứ cấp kỵ nước, đôi khi nó cần hoạt hoá bề mặt PEEK  thông qua nhiều lần tiêm.

SO SÁNH MaxPeak HPS

ĐỐI VỚI CÁC CỘT PREMIER

VÀ QuanRecovery

VIALS VÀ PLATES

MaxPeak HPS là một tập hợp của

bề mặt mới được thiết kế để giải quyết những thiếu sót của vật liệu truyền thống được sử dụng trong

các phân tích sắc ký. Các cột Pha đảo và HILIC PREMIER được sản xuất với bề mặt LC mới bao gồm vật liệu lai Hữu cơ/vô cơ, điều đó giảm thiểu sự tương tác chất phân tích khi chảy qua bề mặt kim loại.  Ngược lại, QuanRecovery Plates và Vials được làm giàu oxy bề mặt phục vụ cho quá trình ngăn chặn và giảm hâp phụ kỵ nước giữa chất phân tích và polypropylene.

MaxPeak HPS đối với CỘT HPLC

Để giải quyết những thách thức này, Waters ™ đã phát triển một nhóm công nghệ có tên MaxPeak High Surface Performance (HPS) được sử dụng cho Phần cứng của cột HPLC, công nghệ này cung cấp hàng rào hiệu quả cao giúp giảm thiểu tương tác không mong muốn giữa chất phân tich với bề mặt kim loại (Hình 1).

Hình 1. MaxPeak HPS được sử dụng trong các cột PREMIER để cản trở các chất phân tích giàu điện tử  tương tác với bề mặt kim loại

Điều này đã được thực hiện bằng cách việc sử dung nội bộ, sản xuất chuyên dụng đặc biệt. Quy trình sản xuất mới này liên quan đến kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt. Hoá chất bề mặt được điều chỉnh để tạo ra thuộc tính thích hợp nhấy cho một hoặc nhiều chế độ sắc ký. Chúng ta đã phat triển một chất hoá học bề mặt rất thích hợp với pha đảo (RP) và pha thuận (HILIC) trên cơ sở cac hạt lai Hữu cơ/vô cơ tương tự như hạt lại BEH (cầu Ethylen).  Bề mặt MaxPeak HPS LC này bao gồm một lớp lớn liên kết chéo cầu ethylene- nhóm siloxan. Điều này khác với Công nghệ MaxPeak HPS đã được sử dụng trên QuanRecovery ™ Autosampler Vials  và Plate để giảm thiểu liên kết không đặc hiệu kỵ nước (NSB).

Tóm lại, các công nghệ MaxPeak HPS được tạo ra dựa trên sự hiểu biết về thuộc tính bề mặt sắc ký yêu cầu để giảm thiểu các tương tác không mong muốn với các chất phân tích trong yêu cầu ứng dụng LC.

LỢI ÍCH ĐỐI VỚI SẮC KÝ VÀ LC-MS

MaxPeak HPS cung cấp các cải tiến trong việc tách và phát hiện các chất phân tích nhạy vơi kim loại, từ acid hữu cơ và organophosphates thành oligonucleotide, peptide, glycan,và các phospholipid. Những cải tiến này bao gồm giảm yêu cầu điều hoà, thu hồi nhiều hơn, cải thiện tính đối xứng peak, giới hạn phát hiện thấp hơn và phổ khối chất lượng cao hơn.

Một số lợi ích này được minh họa trong Hình 2 và Hình 3, trong đó kết quả sắc ký và khối phổ được hiển thị.

Hình 2. So sánh kết quả tách cột tiêu chuẩn so với cột PREMIER cho Chuẩn Oligonucleotide MassPREP. Sự phân tách gradient axetonitril được thực hiện bằng cách sử dụng cột ACQUITY UPLC Oligonucleotide BEH C18, 130 Å, 1,7 µm, 2.1 x 50 mm. Pha động: 25 mM hexylammonium axetat trong nước (pH 6,0), nhiệt độ cột là 60°C và tốc độ dòng 0,4 mL / phút. Các Peak cực đại được phát hiện bằng độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm. Thực hiện ba lần tiêm liên tiếp hỗn hợp chứa 10 pmol của mỗi oligonucleotide.

Hình 3. Lợi ích của công nghệ MaxPeak HPS đối với phân tích LC-MS. (A) Sắc ký đồ MS của tryptic peptide 37 từ NISTmAb sử dụng tách gradient với động chứa 0,1% (v / v)  acid formic với cột ACQUITY UPLC CSH C18, 130 Å, 1,7 µm, phần cứng cột tiêu chuẩn (màu xám) so với phần cứng MaxPeak HPS (màu đen). (B) Khối lượng chế độ ion âm quang phổ cho axit xitric thu được với pha động axit formic 0,1% và Cột ACQUITY UPLC CSH Phenyl Hexyl, 1,7 µm được nhồi trong hai cột tiêu chuẩn (trên cùng) hoặc cột MaxPeak HPS (dưới cùng).

Hình 2 cho thấy sắc ký đồ từ sự tách gradient của hỗn hợp các oligonucleotit thu được bằng cách sử dụng hai cột. Mẫu chuẩn là MassPREP ™ Oligonucleotide Standard (một hỗn hợp của deoxythymidine với 15, 20, 25, 30 và 35 nucleotide). Cột ACQUITY ™ UPLC ™ Oligonucleotide BEH C 18, 130 Å 1,7 µm sử dụng thép không gỉ tiêu chuẩn so với cột có MaxPeak HPS (được đặt theo tên PREMIER) đã được so sánh. Ba lần tiêm liên tiếp được thực hiện trên mỗi cột. Kết quả cho thấy, cột chuẩn cho kết quả chiều cao peak rất thấp trong lần tiêm đầu tiên, chiều cao tăng dần trong các lần tiêm tiếp theo. Ngược lại, cột PREMIER cho chiều cao peak phù hợp với cả ba lần tiêm. Điều này chứng tỏ các cột PREMIER có nhu cầu điều chỉnh giảm xuống để đạt được chiều cao peak thống nhất đối với chất phân tích nhạy với kim loại.

Công nghệ MaxPeak HPS cũng được tìm thấy để cải thiện sự tách peptide. Những lợi ích rõ rệt đã được tìm thấy không chỉ cho các peptit được phosphoryl hóa mà còn đối với các peptit chứa nhiều dư lượng axit, chẳng hạn như cái gọi là peptit PENNYK từ kháng thể đơn dòng. Hình 3A thể hiện rõ sắc ký MS của peptide này khi dược tách bằng cột tiêu chuẩn ACQUITY UPLC CSH C18 , 130 Å, 1,7 µm so với dòng  PREMIER. Khi phân tích 10% đáy của peak, việc giảm đuôi đáng kể có thể quan sát trên cột  PREMIER, cho phép 2 đỉnh peak nhỏ tách ra và được định lượng chinh xác. Các Peak nhỏ này phát sinh tử các biển thể khử amit của peptide PENNYK, và các khu vực tương đối cần được giám sát để kiểm soát chất lượng phương phap điểu trị bằng kháng thể đơn dòng.

Công nghệ MaxPeak HPS đã được quan sát là có lợi cho sắc ký với nhiều chất phân tích thay đổi. Bổ sung cho những hiệu ứng này, thực tế công nghệ này có thể nâng cao chất lượng của khối phổ, có thể quan sát ở hình 3B, trong đó acid citric chuyển hoá được phân tích bằng LC-MS với chất chuẩn hoặc Cột ACQUITY PREMIER CSH Phenyl Hexyl, 1,7 µm. Khi sử dụng cột tiêu chuẩn, một số phổ chế độ ion âm thu được được phát hiện là bị nhiễm các peak từ các chất ion sắt.  Ngược lại, quang phổ thu được khi sử dụng cột PREMIER cho peak sạch với các ion phân tử deproton hoá.  Điều này cải thiện độ nhạy và chất lượng của dữ liệu MS phù hợp. Với sự kết hợp của các lợi ích, Công nghệ MaxPeak HPS giới thiệu một phương tiện mới để cải thiện chất lượng dữ liệu MS và kết quả chính xác hơn.

ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG THÔNG QUA THIẾT KẾ VÀ KIỂM SOÁT QUY TRÌNH

Bởi vì công nghệ MaxPeak HPS được sản xuất bởi một quy trình sản xuất nội bộ, các cột PREMIER đi kèm với mức độ đảm bảo chất lượng cao. Như đã đề cập trước đó, HPS có thể được điều chỉnh để cải thiện hiệu suất sắc ký và giảm thiểu sự hấp phụ các vấn đề trong một số ứng dụng khác nhau.  Do đó, bắt buộc nó phải được kiểm soát chặt chẽ. Một khía cạnh chính của bề mặt là tính kỵ nước của nó, có thể được đánh giá bằng góc đo tiếp xúc giữa nó và một giọt nước nhỏ. Góc tiếp xúc với nước cao hơn tương ứng với bề mặt kỵ nước cao, trong khi góc tiếp xúc nhỏ hơn chỉ ra một trong số đó là ưa nước hơn. Để tham khảo, các bề mặt PEEK có xu hướng thể hiện góc tiếp xúc với nước từ 70-90 độ, trong khi bề mặt MaxPeak HPS hạt lại có cầu nối ethylen mang lại góc tiếp xúc nhỏ hơn 60 độ. Để kiểm soát quy trình sản xuất MaxPeak HPS, điều này và các đặc tính hoá lý khác được đo lường để đảm bảo tính nhất quán.

Trong chiến lược kiểm soát chất lượng Waters, qua trình sản xuất MaxPeak HPS cũng được giám sát để đảm bảo rằng các bộ phận thể hiện độ thu hồi cao khi được sử dụng để phân tích chất phân tích nhạy kim loại. Trong thử nghiệm này, tải khối lượng thấp adenosine triphosphate (ATP) được tiêm và truyền qua frit đã được thông qua quá trình sản xuât và thử nghiệm hệ thống sắc ký không có cột và cột không có kim loại bề mặt . Một giản đồ đơn giản về thiêt bị này được hiển thị trong Hình 4, cùng với kết quả thử nghiệm frit MaxPeak HPS  so với tiêu chuẩn, frit kim loại chưa qua xử lý. Sự thu hồi ATP cao được xác nhận là đạt với MaxPeak HPS frit. Sử dụng kiểm tra này, chất lượng và hiệu suất nhất quán có thể được đảm bảo.

Hình 4. Thử nghiệm kiểm soát chất lượng đối với sản xuất nội bộ của phần cứng MaxPeak HPS. (A) Sơ đồ thiết lập công cụ. (B) Kết quả kiểm tra MaxPeak HPS frit (xanh lam) và frit tiêu chuẩn (đen) để tiêm 10 ng ATP.

KIỂM TRA ĐỘ ỔN ĐỊNH HÓA HỌC

Điều quan trọng là phải đảm bảo rằng phần cứng MaxPeak HPS được sản xuất có thể lặp lại. Để đạt được điều này, thực hiện các hình thức kiểm tra độ bền khác nhau. Cho thử  nghiệm đầu, chúng tôi đã khám phá tính ổn định của MaxPeak HPS đến một số thành phần pha động pH cao và thấp trong khoảng 16 giờ. Mỗi lần kiểm tra bao gồm chu kỳ lặp lại một giờ tiếp xúc với tình trạng khắc nghiệt, rửa giải mạnh để đạt được sự cân bằng và bơm thử nghiệm 10ng  ATP. Ở trên, thử nghiệm được thực hiện trên MaxPeak HPS frit. Sự phục hồi ATP thu được trong các thử nghiệm chính này được hiển thị trong Hình 5. Trong điều kiện pH 12, không co sự thay đổi đáng kể trong sự thu hồi ATP được quan sát thấy ở 60°C, và chỉ giảm chút ít ở 90°C. Ở điều kiện khắt khe pH 1 tại 60 ° C dẫn đến sự thu hồi ít thay đổi, trong khi giảm 20% được quan sát thấy ở 90 ° C.

Thử nghiệm như vậy đã tạo điều kiện cho điều kiện sử dụng nhất định. Ở giá trị pH từ 2–11, 90 ° C có thể được sử dụng mà không cần quan tâm. Giữa pH 1–2 và 11–12, có thể sử dụng nhiệt độ lên đến 60 ° C. Sử dụng hỗn  hợp nước/hữu cơ thay vì sử dụng pha động 100% nước được dự kiến sẽ kéo dài tuổi thọ

Các kết quả ổn định hóa học này xác nhận rằng không có các biện pháp phòng ngừa đặc biệt cho các cột MaxPeak HPS trong điều kiện sử dụng chât chuẩn . Các hợp chất hạt lai ethylen của bề mặt MaxPeak HPS yêu cầu không cần cân nhắc thêm về độ bền hoá học của sắc ký pha tĩnha

Hình 5. Kết quả kiểm tra độ ổn định gia tốc cho một MaxPeak HPS frit. Thử nghiệm PH thấp

được thực hiện với pha động 1% TFA (pH 1) ở 60 và 90 ° C. Thử nghiệm độ pH cao được thực hiện với pha động natri hydroxit 10 mM (pH 12) ở 60 và 90 ° C. Trục y thể hiện độ thu hồi của ATP được đo như  hiển thị trong Hình 4.

ẢNH HƯỞNG CỦA KHỐI LƯỢNG TẢI

Vấn đề hấp phụ các thành phần mẫu lên phần cứng cột được nhiều người biết, nhưng một số nhà phân tich có thể chưa bao giờ trải nghiệm nó hoặc có thể không biết về tác động của nó đối với chất lượng của một phân tích. Điều này có thể được giải thích bằng một số nhân tố:

1. Các chất phân tích quan tâm không thể hiện ái lực đối vớibề mặt kim loại.

2. Việc phân tích được thực hiện ở các mức nồng độ vượt quá khả năng hấp phụ của phần bề mặt cột và chỉ có một tổn thất chất phân tích tương đối nhỏ.

3. Cột LC được điều chỉnh một phần trong thời gian trước sử dụng với việc tiêm lặp lại mẫu hoặc các thành phần giống mẫu.

4. Sự hấp phụ của chất phân tích đối với các thành phần kim loại bị triệt tiêu do thành phần pha động đã chọn, chẳng hạn như pha động có chứa chất đệm photphat.

Chúng tôi đã điều tra sự phụ thuộc vào tải trọng khối lượng bằng cách sử dụng ví dụ sự phân tách của hydrocortisone phosphate được phát hiện bởi độ hấp thụ ở 246 nm. Sự phân tách gradient axetonitril được thực hiện bằng cách sử dụng 10 mM amoni formate (pH 3,0) là pha động trong nước và ở nhiệt độ 30 °C. Chất chuẩn và Cột ACQUITY PREMIER BEH C 18, 130 Å, 1,7 µm, 2,1 x 50 mm đã được sử dụng. Tải trọng khối lượng của hydrocortisone phosphate dao động từ 2-200 ng trên cột.

Hình 6A cho thấy sự so sánh các sắc ký đồ thu được bằng cách sử dụng 2 cột cho tải khối lượng thấp nhất, thể hiện peak hẹp hơn, đối xứng hơn được quan sát khi sử dụng cột PREMIER. Diện tích peak quan sát được trên cột PREMIER  cũng lớn hơn cột chuẩn 83%. Hình 6B cho thấy biểu đồ log diện tích peak so với log tải trọng khối lượng. Kết quả chứng minh rằng các khu vực peak cao hơn được quan sát trên toàn bộ phạm vi khi sử dụng cột Premier, với sự khác biệt tương đối trở nên lớn hơn khi khối lượng tải giảm. Điều này đã được quan sát thấy đối với chất phân tich khác cũng như  và dường như là xu hướng chung.

Hình 6. (A) So sánh sắc ký đồ thu được đối với hydrocortisone phosphate bằng PREMIER(đen) và chuẩn (xám) trên cột ACQUITY UPLC

BEH C 18 , 130 Å, 1,7 µm, 2,1 x 50 mm. Tải trọng khối lượng là 2 ng. Quá trình phân tách gradient axetonitril được thực hiện với pha động ammoni formate 10 mM (pH 3,0) trong nước, tốc độ dòng 0,5 mL / phút và nhiệt độ 30°C. Các peak được phát hiện bằng cách sử dụng đầu dò PDA, với bước sóng 246 nm. (B) Biểu đồ nhật ký của diện tích peak so với tải trọng khối lượng đối với hydrocortisone phosphate được phân tách bằng cột PREMIER (ký hiệu màu đen) và cột tiêu chuẩn (ký hiệu màu xám) chịu tải trọng khối lượng từ 2–200ng.

CÂU HỎI BỔ SUNG

Trong khi cột này thường là yếu tố phân phối nhiều nhất cho các tương tác không mong muôn vơi chất phân tích nhạy với kim loại, hệ thống HPLC và sự va chạm với pha động. Hệ thống HPLC nên được điều chỉnh theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Khi chuẩn bị pha động, nên sử dụng thuốc thử tiêu chuẩn LC-MS đã được chứng nhận tới nồng độ tạp chất kim loại cỡ ppb. Chọn các thùng chứa pha động để tránh ô nhiễm ion kim loại (nên sử dụng hộp nhựa), và không nên sử dụng bộ lọc kim loại. Trong một số ứng dụng LC-MS thử thách, phần cứng cột MaxPeak HPS có thể không giải quyết được tất cả các vấn đề gây ra bằng cách hấp phụ chất phân tích.  Trong những trường hợp này, nồng độ thấp (dưới milimolar) của chất chelat, chẳng hạn như axit xitric, có thể được thêm vào pha động để giảm thiểu  bất kỳ sự hấp phụ còn lại nào.

Cuối cùng, một số mẫu có thể chứa đáng kể nồng độ của các ion kim loại. Theo đó, có thể thấy trước rằng một số xét nghiệm có thể có lợi từ việc thêm chelators và / hoặc chất chuẩn nội phù hợp với mẫu.  Trong trường hợp đó, các trang web quảng cáo còn lại sẽ được điều chỉnh tạm thời với mỗi lần tiêm mẫu. Tương tự,  trong một số trường hợp, nó thậm chí có thể thuận lợi khi thêm phụ gia tạo chelat trong quy trình chuẩn bị mẫu,  đặc biệt là nơi hấp phụ phức tạp và tương tác acid – base Lewis có thể xảy ra.

PHẦN KẾT LUẬN

Các cột PREMIER, được sản xuất với MaxPeak HPS, cung cấp quy trình để để cải thiện phân tích LC của chất phân tich nhạy cảm với sự hấp thụ trên bề mặt kim loại. Không có hiệu suất chạy UPLC và không có tạp chelat trong pha động, giờ đây có thể đạt được sự thu hồi và các peak nhọn với nhiều chất phân tích khó khăn. Với công nghệ MaxPeak HPS , chất phân tích bị cản trở bởi tương tác acid-base Lewis và tổn thất do hấp phụ. Công nghệ này được chứng minh là có hiệu quả trong việc cải thiện việc phân tích các hợp chất giàu electron, như các chất chứa nhóm photphat và cacboxylat. Lợi ích của công nghệ này thể hiển rõ nhất với tải trọng chất phân tích. Những cải tiến đáng kể được nhìn thấy trên ứng dựng RP và HILIC với các hợp chất acid hữu cơ, organophosphate, oligonucleotides, peptides, glycan, và phospholipids.

Để đảm bảo chất lượng và độ tin cậy của công nghệ này, Waters đã thiết lập một năng lực nội bộ để sản xuất và kiểm tra đảm bảo chất lượng. Quan trọng nhất, các khía cạnh chính của qua trình sản xuất MaxPeak HPS, bao gồm cả tính kỵ nước và tính trơ của các bộ phận MaxPeak HPS. Hơn nữa, các bộ phận được làm bằng công nghệ MaxPeak HPS đã được thử nghiệm điều kiện khắt khe để xác nhận độ bền. Nó  đã được chứng minh rằng phần cừng MaxPeak HPS ổn định ở pH 1-12. Không cần cân nhắc đặc biệt cho việc ử dụng các cột PREMIER. Tóm lại, Các cột PREMIER cung cấp cho máy sắc ký lựa chọn mới để phân tich hơp chất nhạy với kim loại và thiết lập các phương phap phân tích chính xác hơn, có độ lặp lại và phân tích mạnh mẽ hơn.